아래 기간에 따른 ÄKTA 보관 방법을 참고하시기 바랍니다.

1. 3일 이내 사용 할 경우

▶ Column CIP 후 장비에서 Column 제거

▶ 아래의 flow path를 모두 DW로 washing

    : pumps, tubing, flow cells, valves, sample loop, fraction collector, accumulator (ÄKTA  avant / ÄKTA pure with an F9-C)

▶ pH probe는 storage buffer에 보관

▶ ÄKTA는 "pause"가 아닌 "end" 상태로 변경

▶ ÄKTA와 UNICORN s/w는 shut down 할 필요는 없음

2. 3일 이상 사용하지 않을 경우

▶ Column CIP 후 장비에서 Column 제거

▶ Pump rinse solution을 fresh 20% EtOH로 교체

▶ 미지근한 DW로 장비 전체 washing (manually or system wash)

    : pumps, tubing, flow cells, valves, sample loop, fraction collector, accumulator (ÄKTA  avant / ÄKTA pure with an F9-C)

▶ 장비 전체를 fresh 20% EtOH로 채움

▶ pH probe는 storage buffer에 보관

▶ UNICORN s/w shut down  à  PC à ÄKTA system 순서로 shut down

제거 하고자 하는 종류, 위치에 따라 Cleaning 시 사용하는 buffer는 아래와 같습니다.

▶ System

▶ pH electrode

▶ UV/Vis flow cell

ÄKTA 장비는 저온(cold room, 냉장고 등)에서 사용 해야 하는 경우, 결로에 의한 장비 고장을 방지하기 위해 몇 가지 주의가 필요합니다.

▶ 장비 설치 시 PC(혹은 노트북)는 상온에 설치합니다.

▶ ÄKTA 장비는 저온에 설치하여 사용 가능합니다.

 그러나, 설치 후 사용하지 않고 장시간 저온 상태로 보관되어 있을 경우, 결로로 인하여 장비가 영향을 받아 장비 구동이 원활하지 않을 수 있습니다.

특히, 장비 미 구동 상태가 2 달 이상인 경우, 저온 쇼케이스에 보관 된 장비는 쇼케이스의 전원을 끄고 문을 열어 내부의 습기를 제거하고,

장비의 전원은 끄고 보관하는 것이 좋습니다.

Sample loop에 sample을 injection 하면, 아래 그림과 같은 형태로 sample이 주입됩니다. 이러한 형태로 주입되는 이유는 sample loop의 바깥쪽(① 위치)이 안쪽(②위치)보다 flow에 대한 벽면 저항값이 높기 때문입니다.

Sample loop 내부의 불균등한 압력으로 인해 원하는 volume 만큼의 sample injection이 되지 않는 경우가 발생합니다.

Sample loss 없이 원하는 volume 만큼의 injection을 위해 아래 2가지 방법을 사용할 수 있습니다.

▶ Partial Loading Loop: Loop Volume의 1/2 이하로 sample을 injection 한다.

▶ Total Loading Loop: Loop Volume의 2배의 sample을 injection 한다.

그림 1. Sample loop의 위치에 따른 압력 차이

그림 2. Sample Loop Loading Rules

ÄKTA 시스템은 다음 단계의 실험 혹은 제품을 위한 대량의 단백질 정제를 위한 장비로, 분획을 받기 위한 정제 시스템입니다.

ÄKTA는 내염성, 저유량, 저압력 크로마토그래피 시스템으로 펌프와 버퍼의 이동 경로, 유연성 및 자동화 기능이 단백질 정제에 최적화되어 있습니다.

HPLC에서 사용되는 고압 조건은 분석용에 적합하며, 단백질의 구조에 영향을 줄 수도 있습니다.

이러한 특징으로 인해 ÄKTA는 단백질 정제에 최적화 되어 있는 시스템입니다.

세포 배양 배지에 포함되어 있는 많은 components는 IMAC 수지와 호환되지 않기 때문에 단백질 정제의 수율을 낮추게 됩니다.

이는 샘플을 로딩하는 동안 IMAC 레진에 고정화 되어 있는 metal ions이 스트립핑이 되기 때문에, 점점 binding affinity가 약하게 되기 때문입니다.

이러한 경우는 EDTA 및 DTT와 같은 환원제에 대해 내구성이 강한 레진,

Ni Sepharose excel 제품으로 교체하면 해결이 될 수도 있습니다.

Ni Sepharose Excel을 이용한다면, 금속 이온 스트리핑을 유발하는 물질을 포함한 배지를 제거하지 않고 샘플을 바로 로딩할 수 있으므로,

워크플로우를 크게 단순화 할 수 있습니다.

단백질에 affinity tag를 추가하면 정제 및 검출이 비교적 쉬우며, target 단백질의 용해도와 안정성을 향상시킬 수 있습니다.

Tag 선택 시 고려할 사항은 정제 목적, Tag 크기, 크로마토그래피 resin의 비용 등이 있습니다.

아래 표는 가장 많이 사용되는 4가지 Tag에 대한 주요 특징을 보여줍니다.

His-tag은 단백질 정제에 일반적으로 가장 많이 사용하는 tag이며,

binding capacity가 높은 반면 purity가 낮은 단점이 있습니다.

Strep-tag는 purity는 높지만 binding capacity가 낮습니다.

GST는 적절한 binding capacity와 purity를 가지고 있습니다.

Cytiva에서 제공하는 레진(resin)의 Expiry date란,

사용하지 않은 레진을 기준으로 COA (Certificate of Analysis: 성적증명서)에 나온 기준값에 대해서 Cytiva가 보증하는 기간을 의미합니다.

실제적으로 레진을 사용하실 때에는 이와는 별도로, 사용하는 정제 프로세스에 따라서 별도의 Lifetime study를 진행하여 최대로 사용할 수 있는 cycle을 검증해야 합니다.

이는 보통 Small scale에서 예측한 뒤에, Large scale에서 확인을 하는 방식으로 진행합니다.

각각의 타겟 단백질과 불순물, 그리고 Cleaning 방식에 따라서 레진의 Lifetime은 달라지므로, 고객이 직접 검증을 해주셔야 하며,

Cytiva에서는 각 레진마다 정제 프로세스 중에서 일반적으로 가장 가혹한 조건인 CIP (Cleaninig-in-Place)를 기준으로 해서 레진의 성능이 유지되는 기간을 조사하기도 합니다.

Q-Sepharose™ FF(Fast Flow)에 대한 isopropanol의 장기 보관에 대한 연구가 없기 때문에 권장 드리지 못합니다.

그러나 benzyl alcohol에 대한 호환성은 검증된 용매이니,  isopropanol이 아닌 benzyl alcohol을 권장 드립니다.

이 외 다른 크로마토그래피 레진에 대한 저장 용매는 각 제품의 Data File을 보면 확인이 가능합니다.

컬럼 팩킹을 한 뒤에나 오래도록 보관되었던 컬럼은 제대로 팩킹이 되었거나 유지되어 있는지에 대해 살펴볼 필요가 있으며,

일반적으로는 흡광도나 전도도의 변화를 가지고, 이론 단수나 비대칭성을 통해서 컬럼의 효율성을 평가하게 됩니다.

추가적으로 오래도록 보관이 되어 있던 경우에는,

보관 전 클리닝 되었던 상태에 따라서 오염이 되는 경우가 있으므로, 사용하기 전에 깨끗하게 클리닝을 한 뒤에 사용을 하시는 것이 좋고,

장기 보관 시에도 주기적으로 보관 용액을 교체해주시는 것이 좋습니다.

또한 Buffer의 부족으로 column이 dry 된 경우 column performance에 큰 영향을 줍니다. 특히 Gel filtration column의 경우, packed bed의 상태에 따라 크로마토그램의 분리능에 큰 영향을 받습니다. IEX와 AC의 performance에 영향을 줍니다.

레진이 dry 되면 packed bed에 cracking이 형성되어 performance가 정상으로 나오지 않을 수 있습니다. Dry 된 resin은 re-packing하여 사용하는 것을 권장합니다.

컬럼은 기본적으로 충진되는 크로마토그래픽 미디아 (레진)의 특성에 따라서 제대로 된 성능이나 장기적인 사용을 위해 적절하게 팩킹이 되어야 합니다.

그렇기 때문에 컬럼 팩킹은 사용되는 레진과 컬럼의 타입에 따라서 팩킹 방법이 적절히 선택이 되어야 하며, 기본적으로는 Flow/pressure 방법을 사용하여 빈 컬럼의 튜브 내부에 적절한 농도의 레진 슬러리를 부어준 뒤에, 상단 아답터를 통해 팩킹 용액을 일정 유속, 또는 일정 압력을 주어 팩킹을 진행하게 됩니다.

팩킹이 제대로 진행이 되어야 하는 이유는 컬럼의 타입이나 레진의 특성 또는 사용될 조건을 고려하지 않은 채 팩킹이 되면, 분리 효능 자체에도 문제가 생길 수 있으며, 사용하면서 컬럼 내부 상태가 변하거나 레진이 변성될 수 있기 때문입니다.